TRANSFERENCIA DE EMBRIONES ( COLECTA, EVALUACION. CONGELACION DE SEMEN Y EVALUACION POSCONGELACION) parte 1: COLECTA DEL SEMEN EN LA T.I.

1.    COLECTA DEL SEMEN

Existen diferentes métodos para la recolección de semen en los bovinos, entre los cuales tenemos:

ü  La vagina artificial

ü  Electroeyaculación

ü  Masajes de las glándulas genitales accesorias.

El más comúnmente utilizado es la vagina artificial, por cuanto ofrece al macho, condiciones parecidas a la vagina de la hembra. 

• LA VAGINA ARTIFICIAL

• PARTES:

- Funda interna: goma elástica o de látex que se ubica en el interior del tubo cilíndrico y representa las paredes de la vagina esta puede ser lisa, sus extremos se doblan sobre la parte externa del tubo y se fija con bandas de caucho. 

- Cono de látex: se fija en uno de los extremos de la vagina cerca de la válvula para el agua. 

- Tubo colector de semen: se coloca en el otro extremo del cono; este tubo está protegido por una cubierta protectora, que generalmente es una jeringa plástica, cuya finalidad es proteger el semen de la luz y de los cambios de temperatura.

• ARMADO DE LA VAGINA ARTIFICIAL:

- Revisar que la vagina y las mangas estén completamente secas (agua espermicida).

- Introducir la magna elástica dentro de la vagina y  aplicar gel lubricante en los extremos para facilitar cubrir los extremos de la vagina.

- Los extremos de la funda se doblan sobre la parte externa del la vagina y esta debe quedar completamente lisa en su interior (sin arrugas).

- El Cono colector se ubica en uno de los extremos de la vagina (la que está cerca de la válvula para el agua.)  y se fija con bandas de caucho. 

- En el extremo del cono colector colocamos el tubo recolector.

- Se procede a calentar el agua a temperatura (50°a 55°C), para cuando se proceda a realizar la recolección haya llegado a temperatura promedio de 40 a 43°C simulando la temperatura corporal (depende del animal).

- Llenamos la vagina con el agua: cubrimos la con un guante la el otro extremo de la vagina para evitar la entrada de agua (espermicida), iniciamos el llenado inclinando la lentamente la vagina.

- Tapamos la válvula de entrada de agua y procedemos a soplar para darle la rigidez simulando la vagina de la vaca; aplicamos gel lubricante en el interior de la vagina.

- Introducimos un termómetro en su interior para estar controlando la temperatura (40 A  43°C)

- El tubo protector lo llenamos de agua tibia (40 a 42°C).

- En un extremo del tubo colector colocamos una goma que asegure al tubo protector (Protege de la luz y temperatura).

- El toro debe ser estimulado con una vaca o novilla que se encuentre en celo para estimular la excitación y sucesiva eyaculación; el animal utilizado para señuelo no será servido por el Toro. FALSA MONTA.

- En el momento que de la protrusión del pene, se desvía con la mano y se introduce en la vagina artifial  y es allí en donde será depositado el semen.

- El semen colectado es llevado al laboratorio protegiéndolo de la luz y es sometido a un completo examen de viabilidad.

• ELECTROEYACULADOR

En este método se hace uso de un electroeyaculador que no es más que un electrodo conectado a una batería que genera estimulaciones rítmicas provocadas por corrientosos no mayores a 20 voltios.

• PARTES:

-  Partes del electroeyaculador: Bala, Batería, Porta cono, Cono colector, tubo colector, Tubo protector.

• PREPARACION DEL ELECTRO EYECULADOR:

Introduzco el cono de colecta dentro de la porta cono.

Al extremo del Cono de colecta fijo el tubo de colecta.

El tubo protector lo llenamos de agua tibia (40 a 42°C). En un extremo del tubo colector colocamos una goma que asegure al tubo protector (Protege de la luz y temperatura).

• COLECTA

- El animal debe estar debidamente sujetado.

- Se realiza el lavado prepucial.

- electroeyaculador es introducido en el recto del toro y su función es estimular las gandulas anexas del aparato reproductor del toro para facilitar el eyaculado. La estimulación no extendera a más de cinco minutos. El toro estimulado lograra la protrusión del pene entre 5 y 8 minutos después de iniciada la estimulación, en algunos casos se debe ayudar al toro.

- Se deja que el toro expluse el material preseminal y se procede a colocar el cono de colecta.

• MASAJES DE LAS GLANDULAS GENITALES ACCESORIAS

• VAGINA ARTIFICIAL: Es un método muy práctico y da muy buenos resultados.

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (RECOLECTA, EVALUACION Y CONGELACION DE EMBRIONES). parte 3: EMPAJILLADO DEL EMBRION Y CONGELACION EN LA T.I.

3. EMPAJILLADO DEL EMBRION Y CONGELACION

• EMPAJILLADO DEL EMBRION

Para ello vamos a utilizar una jeringa de insulina y una punta de pipeta. Ponemos la pajilla esteril dentro de la punta de pipeta y con la jeringa aspiramos una columna de medio enriquecido (HOLDING), luego una columna de aire, nuevamente una columna de medio y una columna de aire.

Teniendo dos columnas de medio y dos columnas de aire aspiramos el embrion con su respectivo medio (HOLDING o EG) y repetimos el procedimiento anterior y por ultimo le colocamos el plugs,

Una vez empajillados los embriones hacemos uso de la congeladora.

NOTA: Después de sumergir los embriones en el etilenglicol se recomienda no exceder un tiempo de cinco (5) minutos, para su respectiva congelación.

•  CONGELACION

Para lo cual requerimos del FREZZER CONTROL.

- Encendemos el switch posterior y Chequear la carga de la batería  (tes button).

- Levantar la crio cámara y deposite 5cm de nitrógeno.

- Conectarla crio cámara  en el toque posterior.

- Coloque el control de temperatura en HOLD.

-    Seleccionar la curva de congelación: Depende  del manual  del frezze y del medio de congelación  etilenglicol o glicerol, la más recomendada en esta ocasión la curva de congelación numero 2, esta curva me determina la relación del descenso de los grados  con respecto al tiempo.

- Encienda el equipo (Switch frontal).

- Colocar la tapa de la crio cámara.

- Llenar de nitrógeno completamente.

- Oprimir Reset (la temperatura baja  a -6°C), para eliminar alguna programación anterior

- Colocar las pajillas en la cámara.

- Se realiza el SEEDING:  Con un hisopo de algodón aplicamos un poco de nitrógeno líquido en las puntas de la pajilla. Esto evita que al congelar la pajilla se formen cristales que dañen el embrión.

- Se oprime el botón RUN, se verifica el nitrógeno y tapar.

- Luego de esto procedemos al congelamiento gradual de los embriones primero a -6°C; luego a -32°C y por último a -196°C.

Hay que tener presente que los embriones congelados deben ir siempre en las canastillas de abajo e inmersos en nitrógeno.

Se guardan en los termos almacenadores en su respectiva canastilla o goblest bien identificado

 

  

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (RECOLECTA, EVALUACION Y CONGELACION DE EMBRIONES). parte 2: EVALUACION DE ESTRUCTURAS EN LA T.I.

2.  EVALUACION DE  ESTRUCTURAS

Después de la colecta pasamos al laboratorio para analizar las estructuras recolectadas.

·         Lavado del filtro de colecta: recolectamos PBS en una jeringa y procedemos  a lavar el filtro completamente con el PBS hasta retirar todas las estructuras y las depositamos en una caja petri

Se buscan los embriones y estructuras infertilizadas con magnificación 15x.

Una vez encontrados se separan los ovocitos infertilizados y los embriones degenerados de los buenos o viables.

- Excelente:    Embrión ideal células de Masa esféricas simétricas.

    Simétrico con células de uniforme tamaño.

    Color y textura ideal

- Bueno: Embrión Normal La morfología es similar al embrión excelente

Algunas células degeneradas (10% y bajo de irregularidades)

- Regular:       Regulares problemas

   Blastómeros Extruidos

   Vesiculación

   Células Degeneradas (10-30% irregularidades)

- Pobre:        Severos problemas

Numerosos blastómeros extruidos

Células de variados tamaños

Mayor numero de vesículas

Células degeneradas del 30-50% de irregularidades)

- No Usar:    Estructuras no fertilizadas NF

Estadios muy tempranos ET

Degenerados Deg

Los embriones viables se llevan a otra caja de Petri con HOLDING (medio enriquecido de conservación) y una vez haya terminado la búsqueda y clasificación se lavan de 5 a 10 veces este lavado consiste en depositar 10 gotas de medio enriquecido en otra caja de petri y pasar los embriones de gota en gota

Si los embriones van a ser transferidos en fresco se empajillan en medio enriquesido y si van a ser congelados se empajillan en Etilenglicol (EG).

 

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (RECOLECTA, EVALUACION Y CONGELACION DE EMBRIONES). parte 1: PROCESO PARA T.I.

1.    PROCESO PARA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

PROTOCOLO DE SUPEROVULACION: (SPO) es la inducción de ovulaciones múltiples mediante el uso de gonadotropinas exógenas. Esta técnica es empleada en el procedimiento de producción y colecta de embriones.

TIEMPO: 15 DIAS

DIA	HORA	DOSIS
0		DIB + 50 MG DE PROGESTRERONA (GESTAVET) +2ML  BE
4	6:00 am	3,2 ml pluset
	6:00 pm	3,2 ml pluset
5	6:00 am	2.4 ml pluset
	6:00 pm	2,4 ml pluset
6	6:00 am	1.6 ml pluset + 3 ml PgF2α
	6:00 pm	1.6 ml pluset + 3 ml PgF2α + Retiro DIB
7	6:00 am	0,8 ml pluset
	6:00 pm	0,8 ml pluset
8	6:00 am	PRIMERA  I.A  + 2.5 GNRH
	6:00 pm	SEGUNDA I.A
9	6:00 am	TERCERA   I.A
15	2:00 pm	Colecta, evaluación y Congelación

1.2  COLECTA DE EMBRIONES

Los pasos para desarrollar esta práctica, una vez hayan sido superovuladas e inseminadas las hembras:

• MATERIALES

ü  Guantes de látex

ü  Mangas para  palpación

ü  Alcohol

ü  Jeringa y Aguja calibre 18

ü  Lidocaína

ü  Tijeras

ü  Yodo

ü  Agua

ü  Papel secante

ü  Sonda Foley

ü  Estilete

ü  Sondas de conducción de dos vías

ü  Filtro de colecta
ü  Medio de lavado (PBS o lactato de Ringer)
ü  Gel lubricarte

• PROCEDIMIENTO

- Procedemos  a revisar los materiales y armar el sistema de lavado y colección de embriones:

ü  Desinfectamos el estilete (flameamos todo el estilete)

ü  Lavamos el estilete con lactato de Ringer.

ü  Aplicamos en el estilete gel lubricante

ü  Procedemos a introducir el estilete en la sonda Foley sin sacarlo de su empaque, para evitar contaminación.

- Conectar: el sistema de conducción el filtro de colecta por la vía de

Introducción de la sonda Foley por vía

- Palpación y Ecografía: mediante esta práctica podemos estimar el número de cuerpos lúteos desarrollados en cada ovario.

- Anestesia epidural: En primer lugar, se rasura y desinfecta la región sacro-coxígea. A continuación, se localiza el punto de punción a nivel del primer espacio intercoxígeo mediante balanceo de la cola. Sujetando la cola, se sube y se baja. La primera articulación que se hace obvia caudalmente al sacro será el primer espacio intercoxígeo (Co1-Co2). La aguja empleada para esta punción es de 4 cm de longitud y calibre 18 G. Para asegurarse de que está correctamente ubicada se utiliza la técnica de la gota pendiente –si se halla en el lugar correcto, al poner una gota sobre el extremo de la aguja, ésta es aspirada debido a la presión negativa existente en el espacio epidural. La mezcla anestésica utilizada en este caso está constituida por  un anestésico local (lidocaína, 0.2 mg/kg).

- Higiene de la vulva ,zonas adyacentes y Secado

- Introducción de un brazo por vía rectal

-

- Pasamos vagina, cervix, cuerpo y llegamos al cuerno

- Retiramos un poco el estilete

- Inflamos el balón con medio de lavado (PBS o Lactato de Ringer): hay que determinar y anotar la cantidad exacta de medio de lavado utilizado ya que esa misma cantidad es la que debe retirarse en el momento de desinfler el balón para realizar el lavado en el otro cuerno.

- Sacamos el estilete y conectamos con el sistema de conducción de dos vías

- Liberamos medio y lavamos el cuerno: iniciamos el lavado del cuerno abriendo la llave para que entre el medio y al tiempo masajeando  con suavidad el cuerno para ayudar a desprender las  estructuras.

después de terminar el lavado en el cuerno hay que sacar el liquido (la misma cantidad que se deposito al inicio) de la sonda Foley (desinflar el balón) y volver a realizar el mismo procedimiento en el otro cuerno